AEG oko arctis 1153 GS Uživatelský manuál

Funktionelle Charakterisierung des Prion-Proteins: physiologische Aktivität und pathophysiologische Alteration Dissertation der Fakultät für

Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis 1 ZUSAMMENFASSUNG 1 2 EINLEITUNG 2 2.1 PRION-ERKRANKUNGEN 2 2.1.1 PRION-ERKRANKUNGEN BEIM TIER 3 2.1.2

Material 86 Shrimp-Alkaline-Pho

Material 87 TC Δ116-173-rev GAT

Material 88 5.2 Chemikalien Ag

Material 89 PBS Dulbecco’s +/+

Material 90 5% Horse Serum

Material 91 10 mM EDTA MitoB

Material 92 Shrimp-Alkaline-Pho

Material 93 Minimal Essential M

Material 94 für Röntgenfilme Fa

Material 95 Forma Scientific Bi

Inhaltsverzeichnis 3.1.2.1 Löslichkeitsprofil der Lokalisationsmutanten 30 3.1.2.2 Proteinase K-Sensitivität der Lokalisationsmutanten 31 3.1.2.3

Material 96 Wasserbad MT Roth,

Methoden 97 6 Methoden 6.1 P

Methoden 98 Abbildung 46. Kl

Methoden 99 6.1.5 Generierung

Methoden 100 Konstrukt Primerpa

Methoden 101 Konstrukt Primerpa

Methoden 102 Für die Mutante

Methoden 103 Stunden lang bis

Methoden 104 Penicillin G, 10 µ

Methoden 105 6.4.2 Herstellun

Inhaltsverzeichnis 3.4 TEIL 4: STRATEGIEN ZUR INHIBIERUNG DER PRPSC-PROPAGIERUNG 64 3.4.1 EPIGALLOCATECHIN-GALLAT FÜHRT ZUR VERMINDERUNG VON PRPC

Methoden 106 bei 4°C in Vivaspi

Methoden 107 anschließend auf

Methoden 108 6.4.14 Immunfluor

Methoden 109 6.4.15.1 Radioakti

Methoden 110 Protein-Antikörper

Methoden 111 6.4.18.2 Mitochond

Methoden 112 durch Zentrifugat

Methoden 113 6.5 Induktion von

Bibliographie 114 7 Bibliograp

Bibliographie 115 Büeler, H., R

Inhaltsverzeichnis 5.6 SONSTIGE MATERIALIEN 93 5.7 GERÄTE 94 6 METHODEN 97 6.1 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) 97 6.1.1 STANDARD-PCR 97 6.1

Bibliographie 116 Dorandeu, A.

Bibliographie 117 Higuchi, H.,

Bibliographie 118 Kretzschmar,

Bibliographie 119 Manson, J.C.

Bibliographie 120 Pan, K.-M.,

Bibliographie 121 Rogers, M.,

Bibliographie 122 Stahl, N., Ba

Bibliographie 123 Walz, R., A

Glossar 124 8 Glossar Abb. A

Glossar 125 MEM Minimum Essen

Inhaltsverzeichnis 6.4.17 IN VITRO TRANSLATION 110 6.4.18 MITOCHONDRIEN-IMPORT-ASSAY (IN VITRO-IMPORT) 110 6.4.19 CO-IMMUNPRÄZIPITATION 111 6.4

Lebenslauf 126 9 Lebenslauf N

Molecular Biology of the CellVol. 17, 3356–3368, August 2006Association of Bcl-2 with Misfolded Prion Protein IsLinked to the Toxic Potential of Cytos

PrP to the ER, PrP was missorted to the cytosol andinterfered with yeast growth (Heller et al., 2003).So far, mutations within the N-terminal signal s

Cell Culture, Transfection, Proteasomal Inhibition, andProteinase K DigestionSH-SY5Y cells were cultivated as described earlier (Winklhofer et al., 20

room temperature. Cells were mounted onto glass slides and examined byfluorescence microscopy using a Zeiss Axiovert 200M microscope (Carl Zeiss,Oberko

targeting signal but lacks the C-terminal GPI signal se-quence (designated PrP⌬GPI). Targeting to and import intothe ER of PrP⌬GPI is efficient, but in

fected cells were applied on top of a sucrose step gradient.After centrifugation all mutant PrP constructs were found inthe bottom fraction, whereas w

nucPrP were significantly increased, whereas the protea-some inhibitor had no significant effect on the relativeamount of PrP imported into the ER or mi

These findings revealed that two pathogenic PrP mutants,linked to inherited prion diseases in humans, are missortedto the cytosol and induce apoptosis.

Cytosolic PrP Binds to and Coaggregates with Bcl-2Previous in vitro studies showed that PrP can interact withthe anti-apoptotic protein Bcl-2 and mapp

Zusammenfassung 1 1 Zusammenfassung Prion-Erkrankungen sind tödlich verlaufende neurodegenerative Krankheiten, die in vererbbarer, übertragb

In contrast to the uninfected control, Bcl-2 was predomi-nantly detergent-insoluble in the scrapie-diseased brain(Figure 5E, sc). Of note, infection o

cytoPrP with Hsp70 (Ma and Lindquist, 2001). We thereforeanalyzed a possible interaction of cytoPrP with the cytosolicchaperones Hsp70 and Hsp40. For

Support for the possibility that PrPScitself could induceapoptosis through caspase activation was provided previ-ously in a cell culture model (Hetz e

mutant proteins bind and aggregate with Bcl-2 in spinal cord mitochondria.Neuron 43, 19–30.Prusiner, S. B., Scott, M. R., DeArmond, S. J., and Cohen,

Stress-protective signalling of prion proteinis corrupted by scrapie prionsAngelika S Rambold1, Veronika Mu¨ller1,Uri Ron2, Nir Ben-Tal2, KonstanzeF W

(Rambold et al, 2006). Cells were exposed to the excitotoxinkainate and apoptotic cell death was determined by thedetection of activated caspase-3. Ec

(Supplementary Figure 1). As a third approach to analysedimer formation, we performed crosslinking experiments.Indeed, a PrP crosslink at a size indic

N2a cells, it appeared that PrPScpropagation does not sig-nificantly interfere with cell viability (Figure 4B), corroborat-ing earlier results (Bosque

neuronal cell death. In prion diseases, neurodegeneration isdependent on the expression of GPI-anchored PrPCin neuro-nal cells (Brandner et al, 1996;

cells expressing wt PrP were co-cultivated with ScN2a cells(Figure 5B; wt). As described above, expression of PrPDHDwas toxic to SH-SY5Y cells; howeve

Einleitung 2 2 Einleitung 2.1

Indeed, cell death in PrP-expressing SH-SY5Y co-culturedwith ScN2a cells was significantly reduced in the presenceof the JNK inhibitor (Figure 6B). A s

monomers were attached to the same cell (Figure 7A), andthe other configuration where the monomers were attachedto adjacent cells (Figure 7B).Different

Remarkably, our co-cultivation approach revealed thatneurotoxic signalling induced by scrapie prions was depen-dent on a physiologically active PrPC(T

addition of 2 mM PMSF. Residual proteins were precipitated byTCA and transfected PrP was detected by western blotting using themAb 3F4.Stress inductio

Holscher C, Delius H, Burkle A (1998) Overexpression of noncon-vertible PrPc delta114–121 in scrapie-infected mouse neuroblas-toma cells leads to tran

,1 ,1,2,3 ,3*Department of Biochemistry, Neurobiochemistry, Ludwig-Maximilians-Universita¨t Mu¨ nchen, Mu¨nchen, GermanyDepartment of Physical Bioche

(reviewed in Winklhofer et al. 2008). How PrPScor neuro-toxic PrP mutants cause neurodegeneration remains elusive(reviewed in Hunter 2006), but differ

Detergent solubility assay, proteinase K digestion of cell lysates,and western blot analysisAs described previously (Tatzelt et al. 1996), cells were

(a) (c) (d) (b) Fig. 1 Epigallocatechin gallate and gallocatechin gallate derived fromgreen tea interfere with the formation of PrPSc. (a) PK-resistan

partially PK-resistant isoform PrPScpartitions into thedetergent-insoluble phase (P), while PrPCis found in thedetergent-soluble fraction (S) (Fig. 1a

Einleitung 3 2.1.1 Prion-Erkra

(b) (a) (c) Fig. 2 EGCG treatment leads to lysosomal degradation of PrPC. (a andb) N2a cells were transiently transfected with 3F4-tagged PrP. (a) Cel

(a)(b)(c)(d)(e)Fig. 3 Binding of EGCG to PrP induces unfolding and the formation ofPK-sensitive aggregates. (a) ITC curves of rPrP90–232 with GCG andE

The effect of EGCG binding on the secondary structure ofrPrP90–232 was analyzed by recording Far-UV CD spectra.Figure 3b displays the CD spectrum of r

kainate (Fig. 5a, kainic acid). However, the protective effectof PrPCover-expression against kainate-induced apoptosiswas significantly reduced in cell

Further studies are now aimed at identifying the domain(s)of PrP that interact with EGCG. Obviously, the unstructuredN-terminal domain of PrP is dispe

Roucou and LeBlanc 2005; Westergard et al. 2007). Usingkainate- and copper-induced apoptosis as a stress paradigm,we corroborated these findings and sh

Marella M., Lehmann S., Grassi J. and Chabry J. (2002) Filipin preventspathological prion protein accumulation by reducing endocytosisand inducing cel

Einleitung 4 1898). Der Einsa

Einleitung 5 Abbildung 2: Sch

Einleitung 6 Krankheit Jahr der

Einleitung 7 Abbildung 3: Sc

Einleitung 8 der Symptomatik, d

Einleitung 9 2.2 Das Prion-Kon

Einleitung 10 ihren biochemisch

Einleitung 11 Die Konversion

Einleitung 12 2.3 Das Prion-Pr

Einleitung 13 Abbildung 6: Bio

Einleitung 14 viele der krankhe

Einleitung 15 2.4 Die physiolo

Danksagung Mein herzlicher Dank gilt meinem Doktorvater Dr. Stefan Jentsch. Ihm möchte ich für die Betreuung meiner Doktorarbeit und

Einleitung 16 2.4.2 PrPC – mög

Einleitung 17 2.4.3 PrPC – mög

Einleitung 18 Histidin-Resten a

Einleitung 19 Abbildung 9:

Einleitung 20 Der Gewinn einer

Einleitung 21 2.6 Neurodegene

Einleitung 22 Hierbei wird da

Einleitung 23 molekularer Ebene

Einleitung 24 only Proteinen

Einleitung 25 2.7 Therapeutisc

Einleitung 26 2.8 Zielsetzung

Ergebnisse 27 3 Ergebnisse 3.

Ergebnisse 28 Abbildung 12:

Ergebnisse 29 Abbildung 13: Di

Ergebnisse 30 kompetenten Mitoc

Ergebnisse 31 Sekretion des P

Ergebnisse 32 Abbildung 16: D

Ergebnisse 33 Die biochemische

Ergebnisse 34 3.1.4 Aggregatio

Ergebnisse 35 Abbildung 19:

Ergebnisse 36 3.1.5 Zytosolisc

Ergebnisse 37 Abbildung 20:

Ergebnisse 38 Aktivität von d

Ergebnisse 39 Serums 3B5 aus

Ergebnisse 40 mittels Western

Ergebnisse 41 ihrer aggregierte

Ergebnisse 42 3.1.7.2 Identifi

Ergebnisse 43 3.1.7.3 Nicht-t

Ergebnisse 44 Abbildung 26:

Ergebnisse 45 Leervektor oder

Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbständig und ohne unerlaubte Hilfe angefertigt habe. Ich habe weder anderweitig versuch

Ergebnisse 46 3.1.9.1 Zytosoli

Ergebnisse 47 Abbildung 27

Ergebnisse 48 3.1.9.2 Überexpr

Ergebnisse 49 Abbildung 28:

Ergebnisse 50 3.2 Teil 2: Die

Ergebnisse 51 Diese Daten zeige

Ergebnisse 52 hergestellt. Die

Ergebnisse 53 3.2.3 Der Verlu

Ergebnisse 54 3.2.4 Die hydrop

Ergebnisse 55 PrPΔHD nur eine

Die vorliegende Arbeit wurde zwischen April 2004 und Juni 2008 am Max-Planck-Institut für Biochemie, Martinsried und am Adolf-Butenand

Ergebnisse 56 3.2.5 Dimerisier

Ergebnisse 57 3.3 Teil 3: Die

Ergebnisse 58 Abbildung 35:

Ergebnisse 59 beobachten (Abb.

Ergebnisse 60 mittels Exosomen

Ergebnisse 61 verankertem wtPrP

Ergebnisse 62 3.3.4 PrPSc indu

Ergebnisse 63 Zusammenfassend

Ergebnisse 64 3.4 Teil 4: Str

Ergebnisse 65 Abbildung 39:

Promotionsgesuch eingereicht am 1. Juli 2008 Tag der mündlichen Prüfung: 30. September 2008 Erster Gutachter: Prof. Dr. Ste

Ergebnisse 66 Abbildung 40: E

Ergebnisse 67 Um der Frage n

Ergebnisse 68 Abbildung 41: D

Diskussion 69 4 Diskussion Pr

Diskussion 70 4.2 Zytosolische

Diskussion 71 Die Tatsache, d

Diskussion 72 deuten darauf h

Diskussion 73 Bcl-2 liegt an

Diskussion 74 4.2.3 Modulation

Diskussion 75 Autophagie (Hoyer

Diskussion 76 4.3.1.1 PrPC zei

Diskussion 77 Membrandomänen s

Diskussion 78 hin, dass PrP-D

Diskussion 79 4.3.2 Funktionel

Diskussion 80 zeichnen sich d

Diskussion 81 guten Blut-Hirns

Diskussion 82 (wie der hydropho

83

Material 84 5 Material 5.1 B

Material 85 Anti-Hase Antikörpe